Лабораторная диагностика инфекций C. trachomatis и N. Gonorrhoeae

 

Введение

Инфекции C. trachomatis и N. разновидность хламидий ной инфекции, и gonorrhoeae  объединяют преимущественно половой путь передачи, широкое распространение, частое бессимптомное носительство, разнообразие клинических проявлений и ряд других общих черт, затрудняющих постановку диагноза. Это диктует необходимость постоянного совершенствования системы их лабораторной диагностики и включения в нее скрининговых методов [3-4].

 

Лабораторные методы диагностики служат основой для постановки диагноза, что обусловлено многообразием клинических проявлений инфекции, вариабельности их выраженности вплоть до отсутствия, возможности ее локализации вне половых органов и мочевой системы.

Методы лабораторной диагностики. Этиологическая диагностика гонореи основана на обнаружении в пробах возбудителя (бактериоскопия, изоляция в питательных средах, обнаружение иммунологическими тестами) или его генома [1-3].

 

Показания к обследованию.

Основными показаниями для проведения лабораторных исследований на гонококковую инфекцию разных категорий пациентов служат [1]:

· Мужчины: клинические проявления уретрита, баланопостита, простатита, везикулита, орхоэпедидимита, эпидидимита простатит и/или конъюнктивит.

· Женщины: симптомы уретрита, цистита, кольпита, бартолинита, цервицита, эндоцервицита и проктита, бесплодие, привычные выкидыши, преждевременные роды, конъюнктивит.

· Дети: гнойный конъюнктивит (новорожденные), вульвовагинит, уретрит.

Также обследуют родителей новорожденных, у которых диагностировали инфекцию гонококка, лиц, подвергшихся сексуальному насилию, вступавших в половой контакт с больным гонореей, проходящих обследование на другие ИППП, до и после лечения трихомониаза, представителей определенных профессий при поступлении на работу и периодических медицинских осмотрах [1-3].

К группам повышенного риска заражения N. gonorrhoeae относятся проститутки, гомосексуалисты, беременные женщины, лица моложе 25 лет, имеющие многочисленных половых партнеров. Контролировать их здоровье и предотвращать распространения инфекции целесообразно иммунологическими (иммунохроматографический тест и др.) и молекулярно-генетическими методами скрининга [1].

Следует иметь в виду, что нередко гонорейная инфекция (особенно у женщин и при локализации инфекции вне половых органов) протекает бессимптомно, со стертыми и неспецифическими клиническими изменениями.

 

У взрослых пациентов пробы берут из цервикального канала, уретры, реже влагалища, прямой кишки, глотки и миндалин с помощью дакроновых или вискозных зондов-тампонов, специальных щеточек, ложек Фолькмана. Мочу собирают в специальные контейнеры (контейнеры для мочи). Пациент не должен пользоваться антисептиками, мазями и другими антимикробными препаратами в течение, по меньшей мере, суток до взятия проб. Нельзя мочиться в течение 4-5 ч до этого, за исключением отбора проб из предстательной железы [1].

Сравнительная оценка методов лабораторной диагностики. Бактериоскопия является референс-методом обнаружения N. gonorrhoeaeв пробах, взятых из уретры мужчин. Сочетает простоту с экономичностью. Нужен большой опыт для выявления и идентификации гонококка этим способом. Поэтому исследуют не один, а несколько мазков, учитывая форму, характер окраски и внутриклеточную локализацию гонококка. Их окрашивают метиленовым синим/бриллиантовым зеленым и по Граму. Для диагностики хронической и стертых форм инфекции применяют метод «провокации» с последующим трехдневным бактериоскопическим исследованием. Бактериоскопия недостаточно чувствительна при исследовании цервикальных, ректальных и фарингеальных смывов, часто дает ложноотрицательный результат на ранней стадии и при бессимптомном течение инфекции [1, 3, 5].

Культуральный метод диагностики пригоден для исследования разных клинических материалов, высокочувствителен и специфичен. К нему прибегают для диагностики инфекции у женщин, детей, половых партнеров пациентов с диагностированной гонореей (если при микроскопии не выявлен возбудитель), в случае сексуального насилия (по запросу следственных органов). Он позволяет диагностировать бессимптомную и экстрагенитальную формы инфекции, определять чувствительность изолятов N. gonorrhoeae к антибиотикам, а также подтверждать эффективность лечения. Из-за высокой чувствительности к факторам внешней среды предпочтительнее делать посевы во время взятия проб у пациентов и доставлять их в лабораторию в кратчайшие сроки при температуре не ниже 18 °С. Если это невозможно, применяют транспортные среды (Стюарта, Эймса). На результаты культурального метода негативно влияют любриканты, спермициды, гормональные контрацептивы, спринцевание половых органов, токсичные компоненты ватных тампонов, сорбенты, низкое качество питательных сред. В состав селективных питательных сред для изоляции гонококка обычно включают линкомицин, ванкомицин, колистин, нистатин, амфотерицин В, триметоприм, которые могут ингибировать рост не только других микроорганизмов, но и части штаммов. Поэтому пробы обычно высевают на селективные и неселективные среды [1, 3].Ответ по результатам посева лаборатория выдает в течение 5 дн.

 

Изоляты нейссерий идентифицируют по морфологическим, тинкториальным, биохимическим и антигенным свойствам. В последнем случае применяют реакции иммунофлюоресценции (РИФ), коагглютинации, иммуноферментный анализ (ИФА) и одноэтапный иммунохроматографический тест (ИХТ). ИХТ наиболее прост, экономичен, быстро дает результат, пригоден для скрининга больших групп населения. Он пригоден для исследования не только смывов из уретры и влагалища, но также мочи. В последние годы в наборы для постановки перечисленных тестов включают не гипериммунные сыворотки, а моноклональные антитела к N. gonorrhoeae, что обеспечивает высокую специфичность [3, 4].

Чувствительность и специфичность молекулярно-биологических методов недостаточны (в частности нередки ложноположительные результаты при исследовании проб с N. lactamica, N. cinerea, N. subflava и другими нейссериями) [1].

 

Лабораторные методы диагностики имеют ключевое значение для диагностики этой инфекции. Не случайно ее называют «новой»: о реальных масштабах распространения C. trachomatis стало известно после внедрения в рутинную практику лабораторных методов диагностики (по данным ВОЗ она занимает второе место среди ИППП).

 

Основными показаниями для проведения лабораторных исследований на инфекцию C. trachomatis служит выявление у пациента при клиническом обследовании нарушений, которыми может сопровождаться любой из вызываемых бактерией синдромов. Около 5% мужчин и 10% женщин являются бессимптомными носителями бактерии [1].

Методы диагностики.

Этиологическая диагностика инфекции C. trachomatis основана изоляции возбудителя в перевиваемых культурах клеток, выявлении его антигенов в РИФ, ИФА и ИХТ, обнаружении его генома молекулярно-генетическими методами, а также выявлении у пациента специфических антител к бактерии в ИФА и иммуноблотинге [1, 3-5].

 

Отбор проб для исследований. Эффективность диагностики инфекции во многом зависит от правильности взятия и доставки клинического материала в лабораторию. Для обнаружения хламидий чаще всего исследуют мазки-соскобы со слизистой оболочки уретры, а у женщин также из цервикального канала, пользуясь для их отбора теми же приспособлениями, что и при гонорее. Дакроновыми зондами-тампонами также берут пробы из глаз, глотки и прочих мест возможной локализации возбудителя (прямой кишки, носоглотки, конъюнктивы, вульвы и пр.). По клиническим показаниям возможно исследование биопсийных и операционных материалов. С внедрением молекулярной диагностики и ИХТ стало возможным обнаружение возбудителя в моче.

Наиболее вероятно обнаружение C. trachomatis в период выраженной симптоматики. Важно, чтобы больной не принимал антибактериальные препараты в течение 3-4 нед, предшествующих обследованию, и не проводил в последние 2-3 дн местных обработок. Желательно брать мазки-соскобы из урогенитального тракта женщин в середине менструального цикла (если нет клинических нарушений) или в дни, когда отсутствуют кровянистые выделения (при обострении болезни).

Для заражения культур клеток пробы доставляют в лабораторию в специальной транспортной среде при температуре 4–6 °С не позднее 24 ч с момента взятия или в замороженном виде (–20 °С) в более поздние сроки. Чтобы избежать колебаний температуры при транспортировке, негативно отражающихся на жизнеспособности хламидий, пробы перевозят в термосумке; с помощью специальных индикаторов можно судить об изменениях в ней температуры [5].

Нативные препараты, предназначенные для исследования в реакции иммунофлюоресценции (РИФ), необходимо в тот же день доставить в лабораторию. Фиксация холодным ацетоном (1–2 мин) увеличивает срок их хранения до 3 дн при 6 °С или до 1 мес при –20 °С [1, 5].

Отделяемое уретры и влагалища, а также мочу (берут только у мужчин) исследуют в ИХТ сразу после сбора, а если такая возможность отсутствуют то их хранят в холодильнике при температуре 2-8°C не более 72 ч.Образцы для молекулярно-генетической диагностики отбирают в микропробирки типа «Эппендорф» и хранят не дольше 3 дн при 4 °С. Исключение составляют пробы мочи, которые должны быть доставлены в лабораторию не позднее 24 ч после сбора (при –20 °С их можно хранить до 1 мес) [1].

Капиллярную или венозную кровь берут в объеме 1,0–1,5 мл берут в вакуумные пробирки с или без ускорителя свертывания. Пробы доставляют в лабораторию в течение 4 ч. Сыворотку можно хранить при –20 °С до 3–4 мес [1, 5].

 

Сравнительная оценка методов лабораторной диагностики.

Наиболее объективные методы диагностики инфекции — выделение C. trachomatis из пораженных тканей в культуре клеток и обнаружение бактерии в РИФ. Культуральный метод пригоден для исследования всех типов проб, но трудоемок, длителен (для получения ответа требуется 7-14 дн), уступает другим методам в чувствительности (на 20-25% РИФ и 40–60% ПЦР). Об изоляции в культуре клеток C. trachomatis судят по результатам РИФ или ИФА. Можно исследовать чувствительность изолятов бактерии к антибиотикам [5].

В РИФ тестируют любой клинический материал кроме мочи и зараженные культуры клеток. Тест проводят со специфическими моно- или поликлональными антителами, меченными флюоресцеином. Чувствительность и специфичность РИФ составляют 80–90% и 98–99%, соответственно, но обнаружить этим тестом хламидий в ректальных и носоглоточных мазках, а также моче, как правило, не удается [1]. Постановка теста и учет результатов посредством флюоресцентной микроскопии требуют больших затрат времени квалифицированных специалистов.

ИФА пригоден для массовых и единичных исследований, экономичен, но имеет низкую чувствительность (40–70%) и не пригоден для тестирования мочи [5].

ИХТ все чаще используют для диагностики этой инфекции. Его преимущества состоят в простоте, низкой стоимости, возможности получения результата в течение 20 мин, что позволяет диагностировать инфекцию даже при первичном обследовании пациента. В нем можно исследовать смывы из половых органов и уретры, а также мочу. Большинство ИХТ выявляют C. trachomatisпо липополисахаридному антигену, что не позволяет дифференцировать разные виды хламидий. Корректность отрицательного результата подтверждают другими лабораторными тестами [3, 4].

Арсенал молекулярно-генетических методов диагностики инфекции C. trachomatisпостепенно расширяется. В настоящее время помимо ПЦР и ПЦР в режиме реального времени с этой целью применяют и другие амплификационные тесты, в т.ч. SDA и NASBA. С их помощью удается не только выявлять в пробах геном хламидий, но и определять их титр, на основании чего можно судить о динамике развития инфекции и результатах проводимого лечения.

Обнаружение специфических антител однозначно не свидетельствует об инфицированности хламидиями, а отрицательные результаты серологических тестов не исключают наличия текущей или перенесенной хламидийной инфекции. Для оценки динамики изменения титра антител различных классов исследуют парные пробы сыворотки крови, полученные от пациента с интервалом в 2–3 нед: о развитии инфекции судят по сероконверсии и ее интенсивности. Cнижение титров IgG и IgА в 2-3 раза в процессе лечения указывает на его эффективность [1, 5].

 

Заключение

Контроль инфекций C. trachomatis и N. gonorrhoeae возможен только на основе лабораторных методов диагностики. Его эффективность можно повысить применением современных методов экспресс-диагностики (ИХТ и др.). Они не только обеспечивают надежную этиологическую диагностику клинических случаев этих инфекций, но также пригодны для скрининга больших групп населения с целью своевременной диагностики их бессимптомной формы и предотвращения распространения возбудителей.

 

Библиография

1. Долгов В.В., Меньшиков В.В. Клиническая лабораторная диагностика Национальное руководство, т. 2. –М: Гэотар-Медиа, 2012.

2. Domeika M., Savicheva A., Sokolovskiy E. et al. Guidelines for laboratory diagnosis of N. gonorrhoeae infections in Eastern European countries - results of an international collaboration. Euro Surveill, 2007, 12, 12.

3. Herring A., Ballard R., Mabey D., Peeling R.W. Sexually Transmitted Diseases Diagnostics Initiative. Evaluation of rapid diagnostic tests: chlamydia and gonorrhoea. Nat Rev Microbiol, 2006, 4, 12, l, 41-48.

4. Kohl K.S., Markowitz L.E., Koumans E.H. Developments in the screening for Chlamydia trachomatis: a review. Obstet Gynecol Clin North Am, 2003, 30, 4, 637-658.

5. Warford A., Cgernesky M., Peterson E.M., Gleaves C.A. Laboratory diagnosis of Chlamydia trachomatis infections. Cumulative techniques and procedures in clinical microbiology. ASM Press, Washington, 1999, 18 p.